紅細胞壽命檢測方法及其應用的研究進展
楊健萍 葉鐵真
510623 廣州醫科大學附屬廣州市婦女兒童醫療中心血液腫瘤科
通信作者：葉鐵真，Email：yetiezhen@163.com
DOI：10.3760/cma.j.issn.1673—419X.2016.05.013
【摘要】紅細胞壽命(RBCS)檢測有助于了解各類型貧血及紅細胞破壞的原因，更是溶血性貧血的診斷“金標準”。然而，迄今仍無一項技術手段可廣泛應用于臨床RBCS檢測。本文在簡要介紹紅細胞清除機制的基礎上，對51Cr標記法、15N-甘氨酸標記法和生物素標記法等幾種常見RBCS檢測方法的原理、檢測步驟、臨床應用及其利弊作一綜述，并且重點介紹一種具有臨床應用前景的RBCS檢測方法--一氧化碳(C0)呼氣試驗。
【關鍵詞】紅細胞衰老； 鉻放射性同位素； 生物素； 一氧化碳
Research progress of measurement methods of red blood cell survival and their applications Yang Jianping,Ye Tiezhen
Department of Hematology and Oncology，Guangzhou Women and Children's Medical Center,Guangzhou Medical University，Guangzhou 510623，Guangdong Province，China Corresponding author：Ye Tiezhen，Email：yetiezhen@163.com
[Abstract]The measurement Of red blood eell survival(RBCS)can help to understand the causes of various anemia and red blood cell breakdown，even more，it is the "gold standard" for the diagnosis of hemolytic anemia.However，so far，there is no appropriate method can be widely used in clinical for RBCS measurement.Here，we brief describ the mechanisms of red blood cells removing firstly，summarize the theory，detection steps，clinical applications，advantages and disadvantages of several measurement methods，such as 51Cr label，15N—glycine label and biotin label，etc..Then we focus on carbon monoxide(C0)breath test，a new method of RBCS measurement which had a broad scope in future clinical application.
[Key words]Erythrocyte aging；Chromium radioisotopes；Biotin；Carbon monoxide
紅細胞壽命(red blood cell survival，RBcs)是指紅細胞從骨髓釋放人外周血液循環后至被網狀內皮系統清除所經歷的時間。RBCS是機體一項重要的生理指標，是判斷紅細胞病理、生理變化的重要基礎。準確測定RBCS有助于了解各類型貧血及紅細胞破壞的原因，更是溶血性貧血的診斷“金標準”。然而，目前由于檢測方法的限制，RBCS檢測仍難以廣泛應用于臨床。本文就RBCS檢測方法的研究進展及其在臨床的應用前景綜述如下。
1 紅細胞清除機制正常成熟紅細胞在血液循環中的壽命為70～140 d，平均約為115 d[1]。正常情況下，紅細胞的清除是非隨機性的，這意味著同一時期生成的紅細胞的衰老程度相近，并且大約在同一時間被網狀內皮系統清除[2]。有關衰老紅細胞被網狀內皮系統清除的機制，一直是相關學者研究的熱點，但是迄今尚無定論。目前，研究者普遍認為在紅細胞衰老過程中，其表面會出現下列主要的特征性變化。
1.1 帶3蛋白修飾
帶3蛋白(band 3 protein)為紅細胞跨膜蛋白，其跨膜部分的主要功能是調節細胞內外的陰離子交換，并被自身抗體識別；其在細胞質的部分則通過與不同的蛋白質結合，從而調節紅細胞的結構與功能[3]。衰老紅細胞膜表面帶3蛋白單體分解和(或)聚集形成二聚體或四聚體，由此產生一種新的抗原，有研究者稱其為衰老細胞抗原。衰老細胞抗原可與血清中的自身抗體免疫球蛋白(immunoglobulin，Ig)G結合形成抗原一抗體復合物，后者最后被肝及脾的巨噬細胞吞噬。上述衰老紅細胞清除機制提示，帶3蛋白的結構變化可能是機體清除衰老紅細胞進程的關鍵步驟[4-5]。Kay等[5]將12只大鼠平均分為維生素E增高組、維生素E正常組和維生素E缺乏組，采用免疫印跡法分別檢測3組大鼠紅細胞膜帶3蛋白分解產物，結果顯示維生素E缺乏組大鼠的帶3蛋白分解產物數量增加，該作者由此結果推斷，紅細胞氧化可能是紅細胞衰老和衰老細胞抗原產生的原因。
1.2膜磷脂酰絲氨酸暴露
1994年Connor等[6]首次提出膜磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)的暴露與機體清除衰老紅細胞有關。此后，這一觀點得到多項研究結果的證實[7-8]。這些研究結果均顯示，正常紅細胞的PS存在于細胞膜內部，隨著紅細胞的不斷衰老，PS逐漸暴露于細胞膜表面，其可被巨噬細胞的CD36受體識別，并且被巨噬細胞吞噬[7-8]。但是，2008年Khandelwal和Saxena[9]的研究卻得出相反結果，他們利用流式細胞儀(flow cytometry，FCM)檢測以脂溶性X-羥基琥珀酰亞胺-生物素標記的小鼠紅細胞，結果顯示，在剛釋放入血液循環的年輕紅細胞中，PS+紅細胞的檢出率為3％～4％，但是隨著紅細胞的衰老，PS+紅細胞檢出率并未升高，而是迅速降低，并維持于1％以下，該結果提示紅細胞PS的暴露可能與衰老紅細胞的清除無關。
1.3衰老紅細胞表達CD47水平降低
2002年，Fossati-Jimaek等[10]研究結果顯示，小鼠衰老紅細胞的CD47表達水平較年輕紅細胞減少約20％，因此推測CD47表達水平降低可能是機體清除衰老紅細胞的機制之一。隨后的研究結果也進一步解釋了CD47表達水平降低的原因，即紅細胞表達的CD47可與巨噬細胞表達的信號調節蛋白(signal regulatory protein，SIRP)α結合，并且釋放抑制性信號，從而阻止紅細胞被巨噬細胞吞噬[3]。
2 直接測定紅細胞壽命的方法
直接測定RBCS是利用不同的標志物標記紅細胞，檢測這些標志物在不同時間點時數量的變化，據此標繪標準曲線，以此推算RBCS。
根據被標記的紅細胞亞群不同，RBCS直接測定方法可分為[2,11-13]：①同齡標記(cohort labels)：即標記某一確定時間段內從骨髓釋放到外周血的新生紅細胞，因此受檢紅細胞日齡相仿。常用于此法的標志物有59Fe、14C、15N等；②全齡標記，又稱為群體標記(population labels)或隨機標記(random labels)法：即標記外周循環血液中所有日齡的紅細胞，常用于此法的標志物有51Cr、99Tc、DF32P(diisopropyl—fluorophosphate)、生物素等。根據標記紅細胞的標志物不同，RBCS直接測定的方法又可分為放射性同位素法、非放射性同位素法和生物素法。
2.1 放射性同位素標記法常用于標記紅細胞的放射性同位素包括51Cr、99Tc和DF32P，其中51Cr最為常用[2]。利用51Cr標記法測量RBCS首先由Gray和Sterling[14]于1950年提出，并且該方法經過不斷改進，曾得到較為廣泛的應用。51Cr標記法基本原理是：在體外51Cr以放射性鉻酸鈉(Na：51CrO4。)的形式與紅細胞結合，即含有六價鉻的鉻酸鹽陰離子通過陰離子通道進入紅細胞，與血紅蛋白(hemoglobin，Hb)非共價結合，隨后六價鉻被還原成三價鉻，從而完成51Cr對紅細胞的標記[11]。51Cr標記法的具體步驟：①將被51Cr標記的紅細胞回輸入檢測對象體內后，在不同時間點采集受血者外周血，并且采用閃爍計數器測量上述不同時間點血液標本的放射性；②以回輸后24 h所采集的第1份血液標本的放射性計數值作為基礎，其后時間點采集標本的放射性與其相比較，即可求得各個時間點紅細胞的生存百分數；③以紅細胞的生存百分數(％)為縱坐標，時間(d)為橫坐標繪制紅細胞的存活曲線，即可通過該曲線推算受血者的RBCS。51Cr標記的紅細胞回輸后，51Cr以每天約1％的相對恒定速率從標記的紅細胞上脫落，并且由于三價鉻不能再次進入紅細胞，所以脫落的51Cr不會再標記其他紅細胞，因此51Cr標記法所測得RBCS需要采用校正系數表進行校正[1-2]。
51Cr標記法的優點包括：①從已標記紅細胞上脫落的51Cr不會再次標記其他紅細胞，因此可避免由于51Cr重復標記紅細胞而對檢測結果產生影響[1-2,11]；②檢測結果重復性好，該方法曾一度被視為RBCS的檢測“金標準”，并且成為臨床診斷溶血性疾病的實驗室檢測指標之一[15]。
但是51Cr標記法也存在下列缺陷：①需多次采集檢測對象的外周血；②一次只能檢測某一日齡的紅細胞群體；③51Cr脫落率在不同血液病患者之間存在差異[16]；④操作繁瑣，測定周期長；⑤具有放射性危害，不宜用于胎兒、兒童和孕婦的RBCS檢測；⑥須對放射性廢棄物進行處理，導致該方法的檢測成本增加[1]。因此，目前全國各醫院均已終止該檢查項目，國外也罕有醫院使用[1]。
Uehida等[16]選擇42例不同血液病患者作為研究對象，納入血液病組；并且選擇12例血液學指標正常的健康個體作為對照組，比較2組受試者采用51Cr與DF32P標記法檢測平均紅細胞壽命(mean red cell life_span，MCL)的結果，并且比較51Cr標記紅細胞時51Cr的脫落率。該研究結果顯示：①對照組12例健康個體通過校正51Cr標記法測得的MCL值為(102.1±10.8)d，采用DF32P標記法測得的MCL值為(111.3±9.1)d，二者比較，差異無統計學意義(P>0.05)；②對照組51Cr脫落率為每天(1.44±0.18)％，血液病組51Cr脫落率為每天0.13％～2.32％，其中再生障礙性貧血患者為(0.66±0.47)％，骨髓增殖性疾病患者為(1.10±0.24)％，缺鐵性貧血患者為(1.13土0.57)％，白血病和淋巴瘤患者為(1.21±0.50)％，遺傳性球形紅細胞癥患者為(1.22±0.13)％，先天性血小板減少性紫癜患者為(1.82±0.08)％，充血性脾大患者為(2.14±0.77)％，自身免疫性溶血性貧血患者為(5.31±2.62)％，而且后兩種疾病患者的51Cr脫落率顯著高于對照組(P<0.05)。
2.2 非放射性同位素標記法
目前使用的非放射性同位素中，50Cr的檢測因需要進行質譜分析或色譜分析，檢測成本較高、技術難度較大，因此其臨床應用受到限制[2]。
15N-甘氨酸標記屬于同齡標記。由于Hb的4個氮原子均來源于甘氨酸[17]，故15N-甘氨酸作為底物參與整個幼紅細胞時期Hb的合成，從而完成15N-甘氨酸對幼紅細胞的標記。被標記的幼紅細胞發育成網織紅細胞并釋放入外周血液循環，隨后分化為成熟紅細胞。因此，隨著紅細胞的成熟，其細胞內的15N-甘氨酸水平逐漸增高。有研究結果顯示，紅細胞內的15N-甘氨酸在標記后2.8～6.3 d達到標志物總量的50％，于標記后20～25 d達到峰值[1]。
15N-甘氨酸標記法的優點包括：①可克服放射性同位素的弊端，標記過程安全、簡便；②適用于胎兒JL童和孕婦的RBCS檢測；③可通過13服給藥標記體內紅細胞[1]，這是本法最突出的優點。
但是，此法也存在以下缺點：①15N-甘氨酸除可標記Hb外，還可能標記其他蛋白質，并可被新產生的紅細胞再利用，從而影響檢測結果；②需要通過質譜分析儀進行檢測。
2.3 生物素標記法
1987年Suzuki和Dale[18]首次建立生物素標記紅細胞的方法。1991年Hoffmann-Fezer等[19]進一步證明生物素標記可用于評估RBCS。常用的生物素有N-羥基琥珀酰亞胺(N-hydroxysuccinimide，NHS)-生物素，硫代-NHS-生物素。生物素在體外通過與紅細胞膜蛋白共價結合的方式標記紅細胞[1]。將被生物素標記的紅細胞(biotinylated red blood cells，BioRBC)回輸至檢測對象體內后，在不同時間點采集外周血，然后利用生物素與抗生物素蛋白之間的高親和力，使BioRBC與含有熒光素的抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素蛋白特異結合[20]，然后采用FCM檢測血液樣本中帶有熒光素的BioRBC數目，并計算不同采血時間點BioRBC占總紅細胞數的百分比。以回輸機體后1～2 h所采集的第1份血液標本的BioRBC百分比為基礎，其后時間點采集標本的BioRBC百分比與其相比較，即可求得各個時間點紅細胞的存活率。以紅細胞的存活率(％)為縱坐標，時間(d)為橫坐標，繪制紅細胞的存活曲線，由此推算受試者的RBCS。
以生物素作為標志物，除具有上述非放射性同位素標記的優點外，還具有自身特有的優勢：①生物素標記的方法十分有利于應用FCM檢測被標記的紅細胞在循環血液中的存活時間；②因為生物素與膜蛋白共價結合，所以很少從紅細胞上脫落；即使出現少量脫落，由于血漿中存在活性生物素激酶，利用FCM仍可檢出生物素，因此該方法由于標志物脫落而對檢測結果的影響較小[20]；③可以利用不同濃度的同一種生物素，或利用不同種類的生物素同時標記多個日齡的紅細胞群體，從而檢測不同群體的RBCS[15,21-24]。
該方法的缺點是：①檢測過程耗時較長；②需要多次洗滌被標記的紅細胞，以去除未反應的試劑和副反應產物；③由于生物素是一種異體蛋白，存在引發變態反應的潛在風險[20]。
為比較不同濃度的生物素對檢測結果的影響，Mock等[15]將8例健康成年人平均分為4個組，分別采用6、18、54和162 mg/mL 4個不同濃度的硫代-琥珀酰亞胺-生物素在體外標記其紅細胞，然后將生物標記的紅細胞分別回輸入受試者體內，并對其回輸24 h后紅細胞回收率(post-transfusion recovery of red blood cells after 24 hours in the circulation，PTR24)，標記后的紅細胞在外周血中減半所需的時間(time to disappearanceof 50 percent of the labeled red blood cells from the circulation，T50)和平均潛在壽命(mean potential life span，MPL)進行檢測。結果顯示：①4個不同濃度生物素組的PTR24。分別為(99.O±3.2)％、(97.9±3.6)％、(98.4±2.1)％和(96.3±5.2)％，4組PTR24比較差異無統計學意義(P>0.05)，該結果提示4種不同濃度的硫代-琥珀酰亞胺-生物素均可獨立且準確地測量PTR24；②6和18 mg/mL生物素組的T50分別為(58±4)d和(57±4)d，該結果與51Cr標記法校正后測得的T50[(52±4)d][25]比較，差異無統計學意義(P>0.05)，MPL分別為(115±8)d和(113±9)d與51Cr標記法校正后測得的MPL[(116±16)d][25]比較，差異亦無統計學意義(P>O.05)，該結果提示低濃度硫代-琥珀酰亞胺-生物素可準確反映長期RBCS；③54和162 mg/mL生物素組的T50和MPL較低濃度生物素組顯著降低，提示高濃度硫代-琥珀酰亞胺-生物素會縮短長期RBCS的檢測結果。
3 間接測定紅細胞壽命的方法
間接測定紅細胞是通過檢測機體排泄物中紅細胞的破壞產物，如膽紅素、鐵元素等，推算RBCS。由于受肝膽、胃腸、腎功能等諸多因素影響，不同個體檢測結果差異較大，所以既往對此法的研究較少，幾乎未用于臨床。近年，有研究者建立了通過檢測受試者呼出氣體中一氧化碳(carbon monoxide，CO)濃度推算其RBCS的方法，以下簡稱“CO呼氣試驗”。該方法經過多年來不斷地改進，已可應用于臨床。
3.1一氧化碳呼氣試驗的基本原理
人體呼出氣體中的CO主要由內源性CO和外源性CO組成。內源性CO來源于Hb降解(占86％以上)和非Hb代謝(不超過14％)，而來源于Hb降解的CO中，85％又來自紅細胞降解，15％來自非紅細胞Hb。因此，人體呼出氣體的內源性CO中，約70％來自于紅細胞降解。當Hb分解為膽紅素時，Hb中的α-亞甲基碳生成CO，即1個Hb產生1個CO分子。因此，在排除外源性CO干擾的前提下，可由機體呼出氣體的內源性CO濃度推算出紅細胞的代謝速度心[26-27]。
根據Strocchi[28]等的研究結果，當機體紅細胞處于生成速度等于破壞速度的穩態時，或者說Hb處于合成速度等于分解速度時，可通過檢測呼出氣體的內源性CO濃度和外周血Hb濃度，并根據下列公式計算RBCS：RBCS(d)-外周血Hb水平×1 380/內源性C0濃度。
3.2一氧化碳呼氣試驗檢測RBCS的方法
最初測量呼出氣體中內源性CO產生量的方法，是讓受試者在一個有規律地排出CO2和輸入02的封閉系統中重復呼吸數小時，并觀察該系統中CO的增加速率直到CO穩定增加。
1992年，Strocchi等[28]報道了一種簡化的方法代替繁瑣的重復呼吸方法，即利用一種模擬人體內CO平衡的裝置，扣除受檢氣體中的外源性CO，從而得到內源性CO濃度。
1999年，加拿大的Natus Medical公司研發了適用于新生兒JL童的測量呼氣末CO(end-tidal carbon monoxide，ETCO)的分析儀，并命名為“Natus CO-Stat End TidalBreathAnalyzer”[29]。
2003年，Furne等[30]發現，由于環境中的CO濃度是十分穩定的,在收集呼出氣體的同時，采集同一環境下的氣體，然后同時測量呼出氣體和環境氣體的CO濃度，可校正呼出氣體中的外源性CO。據此，建立了一種簡單、快速、無創的測量呼出氣體中內源性CO濃度，并據此推算RBCS的方法。該作者應用該方法檢測40例健康成年人呼出氣體中的CO濃度，計算出RBCS為(122±23)d，與既往報道的同齡標記法檢測RBCS的結果相近。
3.3一氧化碳呼氣試驗的臨床應用
多項研究結果表明，溶血性疾病患者ETCO濃度升高。James等[31]選擇21例地中海貧血患者(兒童患者為15例，成年患者為6例)，18例鐮狀細胞貧血(sickle cell anemia，SCA)患者(兒童患者為16例，成年患者為2例)和62例健康個體(兒童為27例，成年人為35例)為研究對象，檢測其ETCO濃度，結果顯示，SCA患者ETCO濃度最高，地中海貧血患者次之，健康個體最低。該結果與Lal等[32]的研究結果相近：16例SCA患兒的ETCO濃度為(4.85±2.24)ppm明顯高于16例正常兒童[(0.96±0.54)ppm]；并且SCA患者中嚴重貧血(Hb<8 g/dL)患兒的平均ETCO濃度為5.43 ppm高于貧血程度較輕者(4.40 ppm)。Christensen等[33]研究結果顯示，20例不同原因所致溶血的新生兒及兒童的ETCO濃度顯著高于20例年齡與之匹配的健康兒童(P<0.000 1)。Christensen等[34]通過檢測100例黃疸新生兒的ETCO濃度，發現37例患兒的ETCO濃度升高，其中1l例患兒發生ABO溶血，其余26例發生不同原因所致的溶血。上述研究結果均提示，ETCO濃度可用于識別貧血患者的溶血反應，并監測溶血的嚴重程度。
Blok等[35]檢測69例早產兒出生后24 h內的ETCO濃度，并隨訪其3歲6個月時的神經發育情況，結果顯示，受試兒童中3歲6個月時神經發育不良者，出生后24 h內的ETCO濃度顯著高于神經發育良好者[(2.7±0.7)ppm比(2.0±0.5)ppm，P 抗病毒藥物利巴韋林的不良反應之一是貧血。為探討利巴韋林引起貧血的機制，Virtue等[36]胡選擇18例丙型肝炎患者作為研究對象，其中13例正在接受利巴韋林治療，5例未使用利巴韋林治療，通過CO呼氣試驗測量受試者RBCS，并且以40例健康志愿者作為對照組。結果顯示，接受利巴韋林治療的丙型肝炎患者中，92.31％出現貧血，其RBCS為(46±14)d，僅為健康對照者[(122±23)d]的38％；5例未使用利巴韋林治療的丙型肝炎患者的RBCS均在正常范圍內[(112±16)d]。該結果提示，利巴韋林所致的貧血的原因是紅細胞破壞增加。 Mitlyog等[37]對21例類風濕性關節炎(rheumatoid arthritis，RA)患者，18例骨關節炎(osteoarthritis，OA)患者和25例因各種慢性疾病而導致貧血的患者進行CO呼氣試驗測量其RBCS。結果顯示，RA組的RBl篤為(90±15)d，各種慢性疾病所致貧血組的RBCs為(87±33)d，較健康個體的(122±23)d及OA患者的(127±25)d顯著縮短(P<0.001)。這提示，RA和各種慢性疾病所致的貧血，與麟縮短有關；而RA患者的Hb水平接近正常，說明RA患者骨髓造血代償能功能較強。 Mitlyng等[36]進行的另一項研究探討人工心臟瓣膜對RBCS的影響。該作者對20例植入機械瓣膜患者和18例植人人造生物瓣膜患者進行CO呼氣試驗測量其RBCS。結果顯示，機械瓣膜患者的RBCS為(99±23)d，人造生物瓣膜患者的RBCS為(103±15)d，兩組比較，差異無統計學意義(P>0.05)，但均較健康個體的[(122±23)d]顯著縮短(P<0.01)，而兩組患者的Hb水平均在正常參考值范圍內，這提示植入人工心臟瓣膜引起的溶血可通過刺激骨髓造血功能得以代償。 多數新生兒可于生后數天發生黃疸，并且部分發展為新生兒高膽紅素血癥，極少數還可發生高膽紅素相關神經發育異常，但是，目前膽紅素相關神經發育異常的發生機制尚未明確。包括大樣本隊列研究在內的數項研究結果提示，伴溶血的新生兒高膽紅素血癥患兒，發生神經發育異常的風險更大[39-40]。因此，對于新生兒黃疸，溶血是一項重要的危險度分層評估指標。新生兒溶血的原因多樣，并且尚無統一的診斷標準。美國兒科學會高膽紅素血癥學組指出，CO呼氣試驗檢測RBCS在新生兒高膽紅素血癥鑒別診斷中的應用，應引起更多的關注[41]。 3.4一氧化碳呼氣試驗的優缺點 與直接測定紅細胞壽命的方法相比，通過CO呼氣試驗檢測RBCS具有以下優點：①簡易、快速，僅需1 h甚至更短時間即可獲取結果；②無創傷，便于重復檢測；③準確度和靈敏度高，可準確反映疾病的嚴重程度。而該法的缺點是：吸煙及肺功能受損者的檢測結果等可能受到影響，因此，本法不適用于此類人群。 4 小結 綜上所述，在目前已有的RBCS檢測方法中，51Cr或生物素標記法由于存在耗時長、操作繁瑣，或需多次采血，或需使用發射性同位素等問題，限制了其在臨床上的使用。而通過CO呼氣試驗檢測RBCS，則因其具有無創傷、無輻射、簡易、快速、準確等優點，為RBCS測定帶來了新的突破，可望廣泛應用于臨床，并有望為修訂貧血的鑒別診斷思路提供具有指向性的、有力的實驗室檢測手段。 利益沖突 無 5 參考文獻 [1] Franco RS.Measurement of red cell lifespan and aging[J].Transfus Med Hemother，2012，39(5)：302-307.DOI：10。1159/000342232. 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