重型/極重型再生障礙性貧血患者紅細胞壽命研究
紅細胞壽命是指紅細胞在循環血液中的存活時間。正常人紅細胞壽命為70~140 d，平均為115 d[1,2]，衰老紅細胞由網狀內皮系統非隨機清除。重型/極重型再生障礙性貧血（SAA/VSAA）包括紅細胞在內的三系血細胞絕對數量的減少源于極度的骨髓造血衰竭[3]，而其成熟紅細胞壽命是否改變以及免疫抑制治療（IST）對紅細胞壽命有何影響卻少有報道。本研究中，我們采用無創測定內源性一氧化碳（CO）的呼氣試驗對51例初診未治和77例免疫抑制治療（IST）后的SAA/VSAA患者的紅細胞壽命進行了檢測，現報道如下。
病例與方法
1. 病例：
以2016年11月至2017年4月于中國醫學科學院血液病醫院貧血診療中心就診的128例SAA/VSAA患者為研究對象，男80例，女48例，中位年齡23（6~66）歲。AA診斷參照國際粒細胞減少與AA研究組1987年標準[4]，嚴重程度分型參照Camitta等1976年標準[5]和Bacigalupo等1988年標準[6]。肝炎相關性AA（HAAA）定義為與肝炎同時或在肝炎患病6個月內發生的AA，血清轉氨酶水平至少達200 U/L[7]?；颊咧委熐熬鞔_診斷及分型，并經仔細詢問病史、查體、常規細胞遺傳學檢查、Ham試驗及流式細胞術檢測嗜水氣單胞菌溶素變異體（Flaer）表達排除低增生性骨髓增生異常綜合征（MDS）及陣發性睡眠性血紅蛋白尿癥（PNH）。40歲以下患者常規進行彗星試驗、絲裂霉素試驗等除外先天性骨髓造血衰竭。51例為初診未治且未接受紅細胞輸注患者，為初診組；77例為IST后至少6個月、可評價IST療效的患者，為IST組。
以13例健康志愿者為正常對照，男3例，女10例，中位年齡36（28~47）歲，中位HGB 134（117~158）g/L。
2. 紅細胞壽命測定：
采用測定內源性CO呼氣試驗方法檢測紅細胞壽命，RBCS-01型紅細胞壽命測定儀為深圳先亞生物科技有限公司產品。采氣時間限定在8∶00至12∶00，采氣前24 h內禁止受檢者吸煙，采氣時受檢者保持空腹、靜息狀態。采氣流程：受檢者首先深吸氣，屏氣20 s，隨之含住密封鋁箔肺泡氣收集袋的單向導氣管并深呼氣；收納受檢者呼出氣的同時以手動氣泵采集同室空氣樣本，上機測定CO濃度，并計算紅細胞壽命。
3. 細胞因子測定：
取SAA/VSAA患者外周血5 ml，應用固相、夾心法化學發光免疫法檢測IL-2受體（IL-2R）、IL-6、IL-8、IL-10和TNF-α水平，試劑盒購自德國西門子公司，嚴格按照試劑盒說明進行操作。
4. 治療方法：
初診組患者檢測紅細胞壽命前未接受任何治療。IST組患者治療方法包括：兔抗人胸腺細胞免疫球蛋白（r-ATG）+環孢素A（CsA）治療6例（7.8%），豬抗人淋巴細胞免疫球蛋白（p-ALG）+CsA治療67例（87.0%），環磷酰胺（CTX）+CsA治療1例（1.3%），單用CsA治療3例（3.9%）。具體用法：r-ATG 3.5 mg·kg-1·d-1，靜脈滴注，第1~5天；p-ALG 20 mg·kg-1·d-1，靜脈滴注，第1~5天；CTX 30 mg·kg-1·d-1，靜脈滴注，第1~4天；CsA以3 mg·kg-1·d-1分2次口服起始，ATG/ALG輸注結束后第1天開始，維持CsA血清谷濃度150~250 μg/L。獲得治療反應前予G-CSF、紅細胞輸注及血小板輸注等支持治療，紅細胞壽命測定時間與末次輸血時間至少間隔2周。
5. 療效判定及隨訪：
療效評定參照英國血液學標準委員會標準修訂，并增加良好部分治療反應（GPR）標準，具體參照文獻[8]。完全治療反應（CR）、GPR、部分治療反應（PR）均為獲得治療反應（HR）。IST后每3個月進行血細胞分析、骨髓細胞形態學、細胞遺傳學檢查及外周血細胞錨連蛋白等檢測評定療效，隨訪截至2017年10月1日。
6. 統計學處理：
采用SPSS 21.0軟件進行統計分析。一氧化碳濃度及紅細胞壽命以均數±標準差表示，采用獨立樣本t檢驗進行組間比較。其他連續變量以中位數（范圍）表示，采用Mann-Whitney U檢驗進行組間比較。分類變量采用卡方檢驗或Fisher精確概率法進行比較。采用Spearman相關分析比較細胞因子與紅細胞壽命的相關性。應用ROC曲線探索初診患者紅細胞壽命預測IST治療反應的界值。P<0.05為差異有統計學意義。
結果
1. 患者一般臨床特征：
128例SAA/VSAA患者中，男80例，女48例，中位年齡23（6~66）歲。初診組51例、IST組77例。77例IST組患者療效反應：CR 40例（51.9%）、GPR 11例（14.3%）、PR 17例（22.1%）、未獲得治療反應（NR）9例（11.7%）。兩組患者一般臨床特征比較見表1。
表1
128例重型/極重型再生障礙性貧血（SAA/VSAA）患者一般臨床特征
2. 初診SAA/VSAA患者紅細胞壽命：
見表2。未經輸血支持的51例初診SAA/VSAA患者紅細胞壽命為（50.69±21.43）d，與正常對照紅細胞壽命[（111.85±31.55）d]相比較明顯縮短（t=-6.611，P<0.001）。中位縮短61.20（50.69~111.85）d，約為正常對照紅細胞壽命的45.3%。
表2
初診及免疫抑制治療（IST）后重型/極重型再生障礙性貧血患者紅細胞壽命比較（
±s）
3．IST對SAA/VSAA患者紅細胞壽命的影響：
77例IST組患者紅細胞壽命為（87.14±39.28）d。HR患者紅細胞壽命為（92.00±38.60）d，較初診組患者明顯延長（t=7.430，P<0.001），而與正常對照組相近（t=-1.743，P=0.085）；其中CR者紅細胞壽命為（106.15±32.12）d，與正常對照者一致（t=-0.558，P=0.579）；GPR者為（74.09±39.19）d，PR者為（70.29±39.28）d，分別較初診患者紅細胞壽命延長23.4 d和19.6 d；未獲得治療反應（NR）患者紅細胞壽命為（50.44±21.56）d，與初診患者相比差異無統計學意義（t=-0.032，P=0.975），與HR患者相比則明顯縮短（t=-4.846，P=0.002）（表2）。
4．SAA/VSAA患者紅細胞壽命縮短的原因：
單因素分析結果見表3。初診組51例患者性別（男/女）、年齡（≤14歲/>14歲）、病因（HAAA/原發性AA）、嚴重程度分型（SAA/VSAA）、外周血細胞參數及是否伴發PNH克隆等因素對紅細胞壽命均無明顯影響。相關性分析結果顯示，初診SAA/VSAA患者血清IL-2R、IL-6、IL-8、IL-10、TNF-α等細胞因子水平與紅細胞壽命均無明顯相關性（rs分別為-0.183、-0.132、0.085、0.183、-0.011，P值分別為0.213、0.372、0.565、0.213、0.943）。
表3
影響初診重型/極重型再生障礙性貧血（SAA/VSAA）患者紅細胞壽命的單因素分析（
±s）
5．HR與否血清細胞因子水平比較：
見表4，HR的68例較NR的9例患者血清IL-2R和IL-6水平明顯減低（P值均<0.05），IL-8、IL-10和TNF-α水平差異無統計學意義（P值均>0.05）。
表4
重型/極重型再生障礙性貧血（SAA/VSAA）患者免疫抑制治療獲得治療反應與否血清細胞因子水平比較[M（范圍）]
6. 治療前患者紅細胞壽命與IST療效的關系：
初診組51例患者中38例后續接受IST并評價3個月療效，其中HR 16例（42.1%），NR 22例（57.9%）。應用ROC曲線分析治療前患者紅細胞壽命不同界值對IST療效的預測作用，其cut-off值為60 d，曲線下面積為0.693（95%CI 0.525~0.861，P=0.044），陽性預測值和陰性預測值分別為66.7%和65.6%，敏感性和特異性分別為37.5%和86.4%。38例患者中9例治療前紅細胞壽命>60 d，IST后3個月HR 6例，NR 3例；29例治療前紅細胞壽命≤60 d，IST后3個月HR 10例，NR 19例，兩組構成比差異無統計學意義（P=0.128）。
討論
除了由于血小板明顯減少可能合并出血外，AA患者貧血的發生通常被認為緣于殘存造血細胞減少，骨髓造血衰竭。本研究我們采用檢測內源性CO生成的呼氣試驗研究初診和IST后獲得不同血液學反應的SAA/VSAA患者紅細胞壽命，結果表明初診SAA/VSAA患者殘存造血生成的紅細胞壽命明顯縮短，IST后6個月HR者紅細胞壽命可恢復正常。本研究我們首次詳細報道了SAA/VSAA患者紅細胞壽命和IST療效的關系，有助于更為詳盡理解SAA/VSAA病理生理機制和紅細胞動力學變化。
早在1918年Ashby就通過差異凝集實驗發現正常人紅細胞壽命約為120 d[9]。此后，多種的紅細胞壽命測定方法陸續研發，包括15N-甘氨酸[10]、51Cr[11]、生物素[12]等紅細胞標記直接測定法，根據血紅蛋白更新速率測算的CO呼氣試驗[13,14]及基于網織紅細胞絕對值的紅細胞壽命快速測算方法[15]等間接測定法。這些不同方法測定或推定的正常人紅細胞壽命與Ashby結果相似。然而，除CO呼氣試驗外，其他方法測定紅細胞壽命多耗時長、需多次采集血液樣本、含有放射性同位素以及基于機體生理狀況和骨髓造血長時間穩定計算，因此難以適用于包括SAA在內的急性、重癥疾病患者。CO呼氣試驗無創、快捷、經濟、與紅細胞標記法結果高度吻合[14]，可滿足不同生理和病理狀態下紅細胞壽命測定，本研究我們即采用該方法進行紅細胞壽命檢測。
文獻報道顯示，采用51Cr標記法在慢性再生障礙性貧血（CAA）患者中測得的紅細胞半壽期均較正常對照縮短[16,17,18]，大多輕度縮短，少數患者紅細胞半壽期正常。迄今尚缺乏SAA/VSAA患者紅細胞壽命相關研究資料。本研究顯示，在初診未輸血的SAA/VSAA患者中，紅細胞壽命為（50.69±21.43）d，較正常對照[（111.85±31.55）d]明顯縮短（t=-6.611，P<0.001），中位縮短61.20（50.69~111.85）d，約為正常對照紅細胞壽命的45.3%。該結果與前期文獻報告AA患者紅細胞半壽期縮短結果相一致，而壽命縮短程度似乎更為明顯。鑒于本研究納入患者均為初診SAA/VSAA，且采用與以往不同的檢測方法，其紅細胞壽命是否確實較非重型AA患者者更短需應用相同檢測方法納入不同患者進一步驗證。
我們對51例初診SAA/VSAA患者疾病特征與紅細胞壽命的關系進行了研究，對包括人口學和血液學多種參數進行單因素分析，未發現與紅細胞壽命相關的變量。提示初診SAA/VSAA患者紅細胞壽命縮短可能與AA基本病理生理過程相關，為疾病本身特征性改變，與性別、年齡、病因等因素無關。而從屬于疾病嚴重程度、微小PNH克隆等特性之間紅細胞壽命亦無差異，可能與納入患者相對均一和樣本量較小有關。ROC曲線分析顯示紅細胞壽命與IST療效預測作用界值為60 d，敏感性和特異性分別為37.5%和86.4%。以治療前紅細胞壽命60 d為分界比較不同紅細胞壽命分組對IST后3個月療效影響，9例治療前紅細胞壽命>60 d，IST后3個月HR 6例，NR 3例；29例紅細胞壽命≤60 d，IST后3個月HR 10例，NR 19例（P=0.128）?？赡芘c樣本量較小相關，宜進一步增加樣本量驗證治療前紅細胞壽命是否可預測IST療效。
AA患者紅細胞壽命縮短的機制不清。研究顯示，CAA紅細胞壽命縮短與紅細胞在脾臟破壞過多[17]及紅細胞膜結構的內在質量、膜蛋白的含量、分布改變繼而使紅細胞膜的穩定性、形態和變形性改變，導致紅細胞壽命縮短直接相關[19]。本研究結果顯示，IST后HR患者較NR患者血清IL-2R和IL-6水平明顯減低。提示紅細胞壽命可能與淋巴細胞因子水平異常改變有關，這與慢性病貧血炎性細胞因子增多引致紅細胞壽命縮短機制相一致。Gardenghi等[20]研究發現，在熱殺傷布氏桿菌誘導的炎性貧血小鼠模型，單核巨噬細胞吞噬紅細胞現象較正常對照小鼠明顯常見，以脾臟噬血細胞現象表現最為明顯。在其他許多類型的炎性狀態下也都觀察到這種單核巨噬細胞系統吞噬紅細胞現象增加、紅細胞壽命縮短[21,22]。細胞因子激活單核巨噬細胞系統，使紅細胞被過多吞噬、分解，紅細胞壽命可縮短40%，被認為與炎性貧血的發生有關[21,23]。我們認為AA是兼有炎性貧血特征的骨髓造血衰竭，其貧血的發生是以骨髓紅系造血減少為基本改變、紅細胞壽命縮短參與共同作用的結果。本研究結果顯示，IST后HR患者除外周血三系血細胞參數明顯升高提示恢復自身骨髓造血外，隨著多種細胞因子水平下降紅細胞壽命也明顯延長或恢復正常，支持這種假設。
IST后SAA/VSAA患者紅細胞壽命可改善或恢復正常，表明AA殘存造血干祖細胞所生成的紅細胞內在質量并無明顯異常。在本研究中，HR患者紅細胞壽命和IL-6等細胞因子水平都較NR患者明顯改善。并且療效質量與紅細胞壽命改善程度相關，獲得CR者紅細胞壽命恢復正常，GPR者明顯改善，而NR者與初診患者一致，仍明顯縮短。提示在現有標準治療方案下，SAA/VSAA患者IST療效的獲得可能與病患個體異常免疫能否得以有效控制相關。鑒于紅細胞壽命縮短與炎性細胞因子激活單核巨噬細胞有關，因而，檢測這一參數IST前后變化可能反映AA異常免疫是否得以控制。
總之，以內源性CO的呼氣試驗方法研究紅細胞壽命結果表明，AA患者紅細胞壽命縮短，經IST可改善或恢復正常；淋巴細胞因子水平升高可能與AA紅細胞壽命縮短有關。AA是兼有炎性貧血特征的骨髓造血衰竭。
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