高清妍 朱陽敏 胡靖 郭潔 鮑本霖 趙馨 葉蕾 李園 彭廣新 李建平 李洋 樊慧慧 宋琳 井麗萍 張莉 張鳳奎

中國醫學科學院血液病醫院　北京協和醫學院血液學研究所，天津　300020

通信作者：張鳳奎，Email: zhfk@hotmail.com

　　摘要目的

　　評估真性紅細胞增多癥（PV）患者的紅細胞壽命，探討其影響因素。方法 連續納入2017年2月至2018年12月中國醫學科學院血液病醫院確診的27例PV患者，以同期18例健康志愿者為正常對照，采用內源性一氧化碳呼氣試驗方法檢測紅細胞壽命，行相關性分析評估其影響因素。結果 27例PV患者中位紅細胞壽命為80（35~120）d，較正常對照組的110.5（69~166）d明顯縮短（P<0.05），平均縮短35.3 d。10例初診PV患者紅細胞壽命為98（35~117）d，17例正在行羥基脲和/或干擾素藥物治療者的紅細胞壽命為69（45~120）d，兩組紅細胞壽命均較正常對照縮短（P=0.010，0.000）。相關性分析顯示，初診PV患者的紅細胞壽命與JAK2突變基因負荷量呈正相關（r=0.900，P=0.037），與外周血淋巴細胞計數（r=-0.742，P=0.014）及血清維生素B₁₂水平（r=-0.821，P=0.023）呈負相關。結論 PV患者紅細胞壽命較健康者縮短約1/3，且與JAK2突變基因負荷量、淋巴細胞計數、血清維生素B₁₂水平相關。

　　【關鍵詞】 紅細胞增多癥，真性 ；紅細胞壽命 ；一氧化碳呼氣試驗

　　DOI:10.3760/cma.j.issn.0578-1426.2019.10.010

　　Red blood cell lifespan detected by endogenous carbon monoxide breath test in patients with polycythemia vera

　　Gao Qingyan;Zhu Yangmin;Hu Jing;Guo Jie;Bao Benlin;Zhao Xin;Ye Lei;Li Yuan;Peng Guangxin;Li Jianping;Li Yang;Fan Huihui;Song Lin;Jing Liping;Zhang Li;Zhang Fengkui(Institute of Hematology and Blood Diseases Hospital,Chinese Academy of Medical Sciences & Peking Union Medical College,Tianjin 300020,China

　　Corresponding author:Zhang Fengkui,Email:zhfk@hotmail.com

　　【Abstract】 Objective To detect the red blood cell lifespan in patients with polycythemia vera (PV), and explore the influencing factors. Methods From February 2017 to December 2018, 27 patients with PV at Blood Diseases Hospital, Chinese Academy of Medical Science and 18 normal controls were recruited. Red blood cell lifespan was detected by endogenous carbon monoxide (CO) breath test. The related factors were analyzed. Results The average red blood cell lifespan of 27 PV patients was 80 (range, 35-120) days (d), which was significantly shorter than that of the normal controls [110.5(69-166) d, P<0.05], namely 35.3 d shorter. The red blood cell lifespan of ten newly diagnosed patients and 17 patients who were treated with hydroxyurea and/or interferon were 98 (35-117) d and 69 (45-120) d, respectively, which were both shorter than that of the normal control (P=0.010, 0.000). Correlation analysis showed that red blood cell lifespan of patients with newly diagnosed PV was associated with JAK2 mutation allele burden (r=0.900, P=0.037), peripheral blood lymphocyte count (r=-0.742, P=0.014) and the level of serum vitamin B₁₂ (r=-0.821, P=0.023). Conclusion The lifespan of red blood cells in patients with PV is about one?third shorter than normal, and is related to JAK2 mutation allele burden, absolute lymphocyte count, and serum vitamin B₁₂ level.

　　【Key words】 Polycythemia vera Red blood cell lifespan Carbon monoxide breath test

　　DOI:10.3760/cma.j.issn.0578-1426.2019.10.010

　　真性紅細胞增多癥(polycythemia vera , PV)是起源于骨髓造血干細胞的慢性獲得性骨髓增殖性腫瘤 (myeloproliferative neoplasms , MPN)，其特征是外周血成熟紅細胞和/或自細胞、血小板異常增多，并伴血勃滯性增高和髓外造血，發生骨髓纖維化和白血病轉化傾向增高^[1-2]。研究表明，絕大多數PV發病與JAK2基因V617F突變相關^［3］，JAK2基因編碼區第1 849位核昔酸由G點突變為T，致使 Janus 激酶 2 蛋白第 617 位氨基酸 頻氨酸被替代為苯丙氨酸，引起細胞自發酷氨酸磷酸化、JAK/STAT通路激活，促進造血祖細胞 對紅細胞生成素 （erythropoietin , EPO） 等造血調控因子反應^［3］。另外 ，近年發現 JAK2 基因12號外顯子、MPL及CALR等基因突變也與PV發病相關。

　　盡管 MPN 患者過量生成的外周血細胞形態大致正常，但對原發性血小板增多癥患者的研究發 現，初診時其外周血血小板壽命較正常人縮短 ，即使經白消安治療后血小板計數恢復正常，其血小板壽命仍明顯縮短^［4］。因而，形態正常的MPN血細胞質量仍可能有異于正常血細胞。我們應用快速內源性 co 呼吸試驗檢測 PV 患者的紅細胞壽命^［5］，以期探究PV病理機制及紅細胞代謝動力學。

　　對象與方法

　　1.研究對象：連續納入2017年2月至2018年12月中國醫學科學院血液病醫院貧血診療中心收治并確診的27例PV患者。所有患者均經仔細詢問病史、體格檢查，完善外周血細胞計數和涂片分類、肝腎功能、動脈血氣分析、骨髓穿刺涂片、骨髓活檢切片病理細胞學分析和網狀纖維染色、JAK2基因12及14號外顯子、CALR基因9號外顯子、MPL基因10號外顯子突變分析、BCR/ABL融合基因檢測、血清EPO水平測定等檢查，除外繼發性紅細胞增多病因，符合PV診斷標準^［6］正常對照組18例，為健康體檢者，既往無慢性病史及異常體格檢查體征，血常規、肝腎功能、心肺功能、尿糞常規檢查均無異常，且在納人研究之前至少8周內無急性疾病、用藥史、吸煙史。

　　2.紅細胞壽命測定：采用內源性co呼氣試驗方法檢測紅細胞壽命^［5］,RBCS-01型紅細胞壽命測定儀由深圳先亞生物科技有限公司生產。采氣前24h內嚴禁吸煙，采氣時間限定在清晨起床8:00至12:00，受檢者保持空腹、靜息狀態。采氣時受試者首先深吸氣，屏氣10s以上，隨之口含密封鋁筒肺泡氣收集袋的單向導氣管深呼氣，去除呼吸道死腔氣體后，收納呼出氣；同時，于動氣泵采集同室空氣樣本。2份氣樣同時送檢，上機測定co濃度。儀器操作嚴格按照儀器使用說明進行。所有患者及正常對照紅細胞壽命均重復測量2次，取平均值。

　　3.統計學處理：數據采用SPSS25.0軟件進行統計分析。計數資料以例數和百分比表示，采用卡方檢驗進行分析；對于計量資料，統一以M（范圍）表示。符合正態分布的資料采用t檢驗，非正態分布資料采用秩和檢驗進行分析。采用Pearson法（正態分布）或Spearman法（非正態分布）進行相關性分析。以P<0.05為差異有統計學意義。

　　結果

　　1.兩組基本情況：27例PV患者，男15例，女12例，中位年齡64(27~79）歲。JAK2基因突

　　變陽性者22例（81.5%），突變基因負荷量中位值為54.60%(0.37%~84.94%）;JAK2、CALR、MPL基因突變均陰性者5例（18.5%）。JAK2突變中，21例為JAK2 V617F突變，1例為JAK2Exon12突變（p.E543-D544del）。27例患者在接受紅細胞壽命檢查時，10例為初診未經任何治療干預患者，17例為院外疑診并已行藥物（羥基脲和/或干擾素）干預治療，兩組患者血紅蛋白水平的差異無統計學意義（P=0.180）。27例患者基線情況見表1。18例正常對照，男5例，女13例，年齡37(25～64）歲，血紅蛋白138(117～157)g/L。

　　2.紅細胞壽命測定（圖1～4）:27例PV患者應用內源性CO呼氣試驗測得紅細胞壽命為80(35～120)d,而正常對照組紅細胞壽命為110.5(69～166)d,PV患者紅細胞壽命較正常對照明顯縮短（P=0.000），平均縮短35.3d，約為正常紅細胞壽命的1/3。22例JAK2突變者紅細胞壽命為77(43～120)d，其中21例JAK2 V617F突變者為74(43～120)d,1例JAK2 Exonl2突變者為83d;5例JAK2,CALR、MPL基因突變均陰性的PV患者紅細胞壽命為100(35～117)d。10例初診患者紅細胞壽命為98(35～117)d,17例藥物治療干預者紅細胞壽命為69(45～120)d，兩組比較差異無統計學意義（P=0.243）；與正常對照比較，初診和藥物治療干預的PV患者的紅細胞壽命均明顯縮短（P=0.010,0.000）。

　　3.影響紅細胞壽命的相關因素分析：我們分析10例未經治療干預的初診PV患者紅細胞壽命相關因素顯示，PV紅細胞壽命與其JAK2突變基因負荷量（r=0.900,P=0.037）呈正相關，與外周血淋巴細胞計數（r=-0.742,P=0.014）和血清維生素B₁₂水平（r=-0.821,P=0.023）呈負相關；與患者性別、現實年齡、初始發病年齡、病程時間（發現紅細胞增多／癥狀出現至紅細胞壽命檢測時間）、外周血臼細胞計數、紅細胞計數、血小板計數、血紅蛋白濃度、血細胞比容、網織紅細胞絕對值、高熒光網織紅細胞比例、總膽紅素、間接膽紅素、細胞因子水平（包括IL-1β,IL-2R,IL-6、IL-8、IL-10）、血清EPO濃度、可熔性轉鐵蛋白受體濃度及脾臟腫大程度無相關性。

　　內源、性co呼氣試驗檢測紅細胞壽命的原理是基于快速檢測肺泡呼出氣體中 co濃度可反映即時機體紅細胞血紅蛋白分解，以間接推算紅細胞活存情況 ^[7] Zhang等^[5] 采用該方法檢測正常人紅細胞壽命為（126±26)d（范圍82～215d），與傳統標記法檢測結果范圍相當，而溶血性貧血患者紅細胞壽命明顯縮短[(29±14)d］。本研究應用內源性CO呼氣試驗法測得18例正常對照紅細胞壽命為110.5(69～166)d，與文獻報道的正常人紅細胞壽命一致^[5]，進一步驗證本方法可行 、結果可靠。

　　早在半世紀前，即有研究應用標記法檢測紅細胞增多癥的紅細胞壽命。London和Shemin^[7]應用¹⁵N甘氨酸標記法檢測1例PV患者的紅細胞壽命，顯示為正常（131d）。Huff等^［8］應用放射活性⁵⁹Fe檢測未治療的PV患者及經放射性同位素治療后未達滿意療效的PV患者鐵代謝轉換率，是正常對照5倍，紅細胞鐵更新速率遠快于機體循環紅細胞數增長，提示此部分PV患者體內存在紅細胞壽命縮短；而檢測繼發性紅細胞增多癥患者鐵周轉率為正常2倍，但其接近根據患者紅細胞數增長值推測的鐵轉換率。Johnson等^［9］應用⁵¹Cr也發現PV患者紅細胞壽命縮短。本研究首次報道應用內源性co呼氣試驗檢測PV紅細胞壽命為80(35～120)d，較正常對照明顯縮短，平均縮短35.3cl。將治療干預因素排除，在初診患者仍顯示紅細胞壽命較正常明顯縮短，這與既往多數采用標記法的檢測結果一致。

　　雖然不同方法檢測PV患者紅細胞壽命多提示較正?？s短，但引起紅細胞壽命縮短的原因尚不十分明確。內游、性co呼氣試驗檢測的是機體整體紅細胞即時血紅蛋白分解，并不能專一地檢測PV JAK2突變克隆生成的紅細胞或正常紅細胞。就紅細胞自身改變而言，本研究相關性分析顯示初診PV患者紅細胞壽命與JAK2基因突變負荷量呈正相關（r=0.900,P=0.037），而非明顯負相關，至少提示紅細胞壽命縮短并非主要是由JAK2突變造血干細胞克隆生成紅細胞異常所致。盡管Berlin等^［10]應用¹⁴C甘氨酸標記紅細胞確實發現PV患者體內存在壽命接近正常和明顯縮短兩群明顯不同壽命的成熟紅細胞，但未能證實壽命縮短的紅細胞群的確切來源。而Bogdanova等^［11］在紅細胞增多癥小鼠中證明新生紅細胞比例增高，Bartos和Desforges^[12]通過檢測PV患者紅細胞酶學的變化，也發現葡萄糖6磷酸脫氫酶、天冬氨酸轉氨酶等在“較年輕”紅細胞中活性較高的酶在PV患者中活性亦明顯升高，提示PV患者體內紅細胞群體可能較為“年輕”，但尚不清楚酶活性改變的紅細胞來源及是否壽命縮短。本研究同樣顯示高熒光網織紅細胞、可溶性轉鐵蛋白受體等標志新生紅細胞生成增多指標與PV患者紅細胞壽命無相關性。此外，Avissar等^［13]檢測了32例PV患者細胞氧化還原酶活性，發現酶活性表現為缺陷的僅有谷胱甘肽還原酶 (glutathione reductase,GR），體外引入其輔因子黃素腺嘌呤二核苷酸（flavin adenine dinucleotide,FAD）后，GR活性可恢復正常，推測過度紅系造血或放血治療導致紅細胞內FAD或其前體核黃素缺乏，可能導致紅細胞壽命縮短。我們的研究顯示PV患者的紅細胞壽命與造血原料含量無相關性，而初診者紅細胞壽命與血清維生素B₁₂水平呈負相關，但維生素B₁₂與紅細胞壽命如何相互影響尚不明確。

　　除紅細胞自身改變外，單核巨噬系統對紅細胞吞噬作用增強也可使紅細胞壽命縮短。Bogdanova等^［11］發現紅細胞增多癥tg6小鼠體外巨噬細胞活性明顯強于野生型，tg6小鼠紅細胞更易被巨噬細胞捕獲，體內示蹤發現肝臟巨噬細胞吞噬紅細胞顯著增加。本研究結果顯示紅細胞壽命縮短與患者脾臟大小無關，提示紅細胞清除及巨噬細胞活性與脾臟大小不成比例。因缺乏有效評價肝臟大小的指標，我們未能證實肝臟對紅細胞壽命的影響。此外，研究發現IFNγ等炎癥細胞因子可引起單核巨噬細胞系統激活，使紅細胞被過多吞噬、分解，紅細胞壽命縮短^［14-15］這提示紅細胞壽命可能與機體炎癥反應有關。我國學者亦發現，IL-2受體、IL-6、IL-8等淋巴細胞因子水平升高可能與再生障礙性貧血紅細胞壽命縮短有關^[16] 。我們對初診PV患者的紅細胞壽命進行相關因素分析，結果顯示患者紅細胞壽命與外周血淋巴細胞計數（r=-0.742,P=0.014）呈負相關，但未發現其與包括IL-113、IL-2受體、IL-6、IL-8、IL-10等在內的細胞因子水平等炎癥介質存在相關性。鑒于樣本數量限制，我們未進行紅細胞壽命與各淋巴細胞亞群相關性分析，無法證實炎癥細胞及其介質對PV患者紅細胞壽命的影響。

　　Pollycove等^［17］通過鐵代謝動力學分析，認為PV紅細胞壽命隨病程發展可由正常變為縮短，患者白細胞、血小板亦存在隨病程發展壽命縮短的現象，推測PV自然病程可能是具有生存優勢的功能性改變的造血干細胞克隆性擴增的結果。然而，本研究結果未提示PV紅細胞壽命與病程時間相關，且初診患者紅細胞壽命與基因突變負荷量呈正相關，故PV病程發展中的紅細胞壽命變化尚需進一步研究。另外，需注意的是本研究中PV組患者中位年齡為64(2779）歲，相關性分析顯示患者紅細胞壽命與年齡無關，既往研究顯示紅細胞壽命不受年齡影響，故我們采用了血液學正常的中青年健康體檢者作為正常人紅細胞壽命對照。未來，擴大不同年齡亞組正常人及PV疾病組樣本量應該可獲得更多確證。

　　Bogdanova等^［11］曾通過EPO過表達引起tg6小鼠出現紅細胞增多表型，發現小鼠紅細胞中加速老化標志物增多，紅細胞壽命縮短（比野生型鼠縮短70%），提示紅細胞加速老化、壽命縮短可能是機體對紅細胞絕對數量增加作出的代償性反應。PV患者出現紅細胞壽命縮短可能亦是機體對JAK2突變引起紅細胞生成絕對增加作出的適應性代償。

　　另外，正在起羥基脲/干擾素藥物治療的PV患者的紅細胞壽命為69(45～120)d，似較初診患者的紅細胞壽命98(35～117)d更短，提示羥基脲、干擾素等藥物干預可能進一步縮短紅細胞壽命。推測羥基脲/干擾素治療除可通過抑制骨髓增殖引起血細胞生成減少，似乎還可通過縮短成熟紅細胞壽命降低PV患者的血細胞壓積。

　　我們首次報道內源性co呼氣試驗檢測PV患者的紅細胞壽命較正常人縮短約1/3,PV外周血血紅蛋白明顯增高可能主要是紅細胞生成增加而非壽命延長所致?？s短紅細胞壽命或是機體代償性減少過量紅細胞生成的代償性反應。

　　利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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（收稿日期：2019-04-29)

（本文編輯：沈志偉）

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